神经花环是模拟早期胚胎发育过程中神经管组织的放射状排列。它们通常由诱导多能干细胞（iPSCs）等多能干细胞培养而成。培养过程首先是利用特定的生长因子和信号分子将这些干细胞分化成神经祖细胞（NPC）,这些结构模拟了早期神经发育过程中出现的线索，也代表了中枢神经系统发育的关键阶段。神经干细胞在这一阶段开始分化为神经元和其他特化细胞类型。
神经花环的发育以 NPC 顶端–基底极化和形成管腔为特征。它与胚胎大脑和脊髓发育早期阶段的神经管中央管非常相似。在这种情况下，管腔代表了未来的脑室系统，脑脊液最终将流向该系统。神经管极化和管腔的集体形成是神经发育的关键步骤，它是正确结构形成的重要标志，有助于深入了解早期神经模式和发育。
神经花环是神经细胞生长的标志，通过体外培养神经花环，可以研究神经元分化、迁移和神经网络形成等过程。科学家通过使用由神经花环组成的球体，更深入地了解大脑发育、疾病建模以及药物或基因突变对神经组织的潜在影响。
在这种情况下，就需要开发快速筛查神经花环的工具，以便快速研究神经花环的发育情况，并评估特定药物对神经花环的影响。
Neurosetta 是一家开发 RosetteArray® 平台的美国公司，该平台包括用于模拟胚胎大脑和脊髓发育的微图案孔板培养物（图 1）。这项技术使研究人员能够评估各种物质和遗传因素对神经发育的影响，帮助识别与人类大脑 和 脊 髓 发 育 有 关 的 潜 在 风 险 。 RosetteArray® 平板采用微图案黄金涂层培养表面，这种微图案的设计经过优化，可诱导每孔形成 100-1000 个大脑和脊髓花环阵列。
Neurosetta
目前已将这一平台商业化，通过可重复、经济高效和高通量的方式筛选人类大脑和脊髓发育的早期阶段的神经花环。
本应用说明旨在证明 RosetteArray® 平板与 X-LightV3 相结合，是快速、准确筛选神经花环的强大而高效的工具。
如图 2 所示，X-Light V3 的大视野（FOV）和拼接功能使我们能够对单个孔内的所有神经花环进行成像。这种采集方式可对不同孔内的神经花环进行快速、初步的筛选，快速验证有多少神经花环已成功形成。此外，如图 2 中的圆圈所示，我们还能评估已形成管腔的神经花环数目。这一信息对于确定每个神经花环的发育阶段至关重要。收集完这些初步数据后，我们就可以将注意力集中在内腔已完全形成的神经花环上，放大倍数以观察细节，从而进行更深入的分析。
X-Light V3 的对角线视场角为 25 毫米，这使我们能够在 60 倍放大率下对整个神经花环进
行更详细的成像。图 3 显示的是神经花环的最大强度投影图（MIP），图中有类黄素（黄色）和包心蛋白（红色）染色。
包心蛋白是一种定位于中心体的蛋白质，它能招募其他蛋白质以确保中心体和有丝分裂纺锤体的正确形成，通过使用包心蛋白的标记物，可以进一步了解神经花环内细胞的成熟情况。具体来说，有丝分裂纺锤体的方向会影响分裂平面，并预测细胞命运的决定，决定分裂是对称和增殖性的，还是不对称和分化性的。这一信息对确定神经花环的发育状态至关重要，还可用于比较两种不同基因型的发育阶段。
细胞分裂时相对于管腔的角度决定了细胞分裂的结果是自我更新还是分化。更具体地说
垂直分裂（顶端壁与有丝分裂纺锤体的夹角在 60 至 90 度之间）导致自我更新分裂。另一
方面，水平或倾斜分裂（角度在 0 至 60 度之间）会导致分化分裂（图 4）。
借助 X-Light V3 光学切片技术，我们能够对靠近管腔的分裂细胞进行成像，并确定有丝分裂的方向。图 5（左）显示了神经花环的管腔和靠近管腔的一个正在分裂的细胞。如图 5
（右）所示，细胞分裂的角度约为 90 度，表明正在进行自我更新的有丝分裂。
图 5：左：神经花环管腔的 MIP（1 微米）；右：分裂细胞的裁剪。白线表示细胞相对于管腔的分裂方向。神经丛染色：DAPI（蓝色）、Phalloidin（黄色）和 Pericentrin（红色）。物镜： Nikon CFI Plan Apochromat Lambda D 60X 油性物镜（1.42 NA，0.15 WD）。
在研究特定药物或基因型对大脑发育的影响时，这种类型的分析证明是必不可少的，因为它能让研究人员在精确的发育阶段高效、快速地观察细胞组织的微妙变化。通过详细了解这些因素是如何影响神经结构的形成和成熟的，这种方法是研究神经发育障碍的有力工具，有助于深入了解疾病机制和潜在的治疗干预措施。
结论
在 本 应 用 说 明 中 ， 我 们 展 示X-Light V3 共焦旋转盘系统与 RosetteArray® 平板与的强大组合。这些工具共同为神经花环筛选提供了先进的解决方案。此外，我们还展示了 X-Light V3 可以对神经花环进行高通量分析，从而快速有效地评估它们的成熟状态，助力神经花环的研究。
致谢
本应用说明是 CrestOptics、罗马萨皮恩扎大学和生命纳米与神经科学中心合作的成果。
我们感谢 Silvia di Angelantonio 教授（罗马萨皮恩扎大学生理学与药理学系；意大利技术研究院生命纳米与神经科学中心；D-Tails srl BC）、Lorenza Mautone 博士（罗马萨皮恩扎大学生理学与药理学系；意大利技术研究院生命纳米与神经科学中心）、Chiara D’antoni 博士（罗马萨皮恩扎大学生理学与药理学系；意大利技术研究院生命纳米与神经科学中心）、Chiara D’antoni 博士（罗马萨皮恩扎大学生理学与药理学系；意大利技术研究院生命纳米与神经科学中心 ），Chiara D’antoni 博士（罗马萨皮恩扎大学生理学与药理学系；意大利技术研究所生命纳米与神经科学中心）、Francesca Nistri 博士（罗马萨皮恩扎大学生理学与药理学系；意大利技术研究所生命纳米与神经科学中心）友情提供了本应用报告中展示的神经花环。
我们还要感谢 Neurosetta公司，特别是 Randolph Ashton 博士和 Gavin Knight 博士，感谢他们提供 RosetteArray® 平板并给予大力支持。
